龟龄集对小鼠肺纤维化的改善作用及作用机制

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-8757.2024.04.002

目的

观察龟龄集胶囊对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的干预效果并探索其作用机制。

方法

60 只10 周龄雄性C57BL/6 小鼠随机分为对照组和龟龄集组（各30 只），龟龄集组再随机分为龟龄集1 组和龟龄集2 组（各15 只），后两组气管内注射博来霉素（5 mg/kg）诱导肺纤维化，分别于第1 天和第29 天开始口服龟龄集胶囊，对照组仅注射等渗氯化钠溶液。于第7、28、90 天处死小鼠，取肺组织。左肺组织行苏木精-伊红染色（HE 染色）和Masson 染色，右肺组织采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测p21、p53、β-连环蛋白（β-catenin）、转化生长因子β1（TGF-β1）、羟脯氨酸（Hyp）含量，采用实时定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）法检测TGF-β1 mRNA 表达。组内不同时间点之间比较采用方差分析，组间比较采用LSD 法。

结果

HE 染色和Masson 染色结果显示，对照组肺组织正常，龟龄集组各时间点均出现纤维化，第28 天最严重，第90 天减轻；龟龄集1 组纤维化程度较龟龄集2 组轻。细胞衰老标志物（p21、p53、β-catenin）和纤维化标志物（TGF-β1、Hyp）表达在龟龄集组均升高，第28 天达峰值，第90 天时龟龄集1 组低于龟龄集2 组（t_p21=-8.713、t_p53=-8.190、t_β-catenin=-10.276、t_TGF-β1=-4.785、t_Hyp=-20.432，P ＜0.05）。TGF-β1 mRNA 表达在龟龄集组升高，龟龄集1 组低于龟龄集2 组（t=4.676，P ＜0.05）。

结论

龟龄集胶囊可改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，其机制可能与抑制细胞衰老标志物和纤维化标志物表达有关。

关键词: 特发性肺纤维化, 龟龄集, 细胞衰老, P53/P21 信号通路, WNT/β-catenin 信号通路

Objective

To investigate the intervention effect of Guilingji on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice and explore its underlying mechanisms.

Methods

Sixty 10-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into a control group and Guilingji group （30 mice in each）.The Guilingji group was further divided into Guilingji Group 1 and Guilingji Group 2 （15 mice in each），and both received intratracheal injection of bleomycin （5 mg/kg） to induce pulmonary fibrosis and were administered Guilingji orally starting on Day 1 or Day 29， respectively.The control group received only an equal volume of isotonic saline solution.Mice were sacrificed on Day 7， Day 28， and Day 90 to collect lung tissues.The left lung tissues were stained with HE and Masson's trichrome， while the right lung tissues were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for the protein levels of p21， p53， β-catenin， transforming growth factor β1 （TGF-β1）， and hydroxyproline （Hyp）， and by realtime quantitative reverse transcription PCR （qPCR） for the mRNA expression of TGF-β1.Comparisons between different time points within the group were conducted using ANOVA， while comparisons between groups were performed using the LSD method.

Results

HE and Masson's staining showed normal lung tissues in the control group， while the Guilingji groups exhibited fibrosis at all time points，with the most severe fibrosis on Day 28 and a reduction on Day 90.The degree of fibrosis was lower in Guilingji Group 1 than in Guilingji Group 2.The expression levels of cellular senescence markers（p21， p53， β-catenin） and fibrosis markers （TGF-β1， Hyp） were elevated in the Guilingji groups， peaking on Day 28.On Day 90， the expression level of these markers were lower in Guilingji Group 1 than in Guilingji Group 2 （t_p21=-8.713， t_p53=-8.190， t_β-catenin=-10.276， t_TGF-β1=-4.785， t_Hyp=-20.432； P ＜ 0.05）.The mRNA expression of TGF-β1 was also elevated in the Guilingji groups， with lower levels in Guilingji Group 1 compared to Guilingji Group 2 （t=4.676， P ＜ 0.05）.

Conclusion

Guilingji can ameliorate bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice， possibly through the inhibition of cellular senescence and fibrosis markers.

Key words: Idiopathic pulmonary fibrosis, Guilingji, Cellular senescence, p53/p21 pathway, WNT/β-catenin pathway

图1 不同时间点各组小鼠肺组织病理变化（苏木精-伊红染色，×200）

图2 不同时间点各组小鼠肺组织病理变化（Masson 染色，×200）

表1 各组小鼠肺组织中细胞衰老相关标志物表达水平比较（±s）

组别	只数	p21（ng/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7 天	第28 天	第90 天	F 值	P 值
对照组	10	1.79±0.03	1.80±0.10	1.81±0.02	0.124	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	2.46±0.06^a	2.68±0.04	2.36±0.05^bcd	4.567	＜ 0.05
龟龄集2 组	5	2.46±0.05^a	2.69±0.03^ab	2.57±0.02^c	5.788	＜ 0.01
组别	只数	p53（pg/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7 天	第28 天	第90 天	F 值	P 值
对照组	10	100.38±1.09	100.84±2.70	101.32±1.03	0.153	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	127.76±1.96	136.04±2.53	121.99±2.16^bcd	12.346	＜ 0.01
龟龄集2 组	5	126.54±2.41^a	137.82±3.60^ab	130.77±1.04^c	14.576	＜ 0.01
组别	只数	β-catenin（ng/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7 天	第28 天	第90 天	F 值	P 值
对照组	10	1.32±0.01	1.41±0.08	1.39±0.04	0.183	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	2.11±0.02^a	2.32±0.04	2.05±0.02^bcd	8.456	＜ 0.05
龟龄集2 组	5	2.07±0.04^a	2.33±0.03^ab	2.18±0.02^c	9.234	＜ 0.01

表1 各组小鼠肺组织中细胞衰老相关标志物表达水平比较（±s）

组别	只数	p21（ng/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7 天	第28 天	第90 天	F 值	P 值
对照组	10	1.79±0.03	1.80±0.10	1.81±0.02	0.124	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	2.46±0.06^a	2.68±0.04	2.36±0.05^bcd	4.567	＜ 0.05
龟龄集2 组	5	2.46±0.05^a	2.69±0.03^ab	2.57±0.02^c	5.788	＜ 0.01
组别	只数	p53（pg/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7 天	第28 天	第90 天	F 值	P 值
对照组	10	100.38±1.09	100.84±2.70	101.32±1.03	0.153	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	127.76±1.96	136.04±2.53	121.99±2.16^bcd	12.346	＜ 0.01
龟龄集2 组	5	126.54±2.41^a	137.82±3.60^ab	130.77±1.04^c	14.576	＜ 0.01
组别	只数	β-catenin（ng/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7 天	第28 天	第90 天	F 值	P 值
对照组	10	1.32±0.01	1.41±0.08	1.39±0.04	0.183	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	2.11±0.02^a	2.32±0.04	2.05±0.02^bcd	8.456	＜ 0.05
龟龄集2 组	5	2.07±0.04^a	2.33±0.03^ab	2.18±0.02^c	9.234	＜ 0.01

表2 各组小鼠肺组织中纤维化相关标志物表达水平比较（±s）

组别	只数	TGF-β1（pg/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7天	第28天	第90天	F 值	P 值
对照组	10	171.76±1.23	171.38±4.02	172.57±2.36	0.215	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	211.16±1.20^a	221.67±3.72	205.09±3.45^bcd	15.677	＜ 0.01
龟龄集2 组	5	209.90±1.43^a	223.24±8.90^ab	214.53±2.75^c	18.345	＜ 0.01
组别	只数	Hyp（ng/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7 天	第28天	第90天	F 值	P 值
对照组	10	19.43±0.14	19.59±0.43	19.96±0.38	0.312	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	20.29±0.28^a	22.53±0.65	19.64±0.23^bcd	7.890	＜ 0.05
龟龄集2 组	5	209.90±1.43^a	223.24±8.90^ab	214.53±2.75^c	25.676	＜ 0.01

表2 各组小鼠肺组织中纤维化相关标志物表达水平比较（±s）

组别	只数	TGF-β1（pg/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7天	第28天	第90天	F 值	P 值
对照组	10	171.76±1.23	171.38±4.02	172.57±2.36	0.215	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	211.16±1.20^a	221.67±3.72	205.09±3.45^bcd	15.677	＜ 0.01
龟龄集2 组	5	209.90±1.43^a	223.24±8.90^ab	214.53±2.75^c	18.345	＜ 0.01
组别	只数	Hyp（ng/mL）			F 值	P 值
组别	只数	第7 天	第28天	第90天	F 值	P 值
对照组	10	19.43±0.14	19.59±0.43	19.96±0.38	0.312	＞ 0.05
龟龄集1 组	5	20.29±0.28^a	22.53±0.65	19.64±0.23^bcd	7.890	＜ 0.05
龟龄集2 组	5	209.90±1.43^a	223.24±8.90^ab	214.53±2.75^c	25.676	＜ 0.01

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